一． 蛋白樣品的制備
按組織凈重（g）：裂解液體積（ml）=1:10 的比例加入相應(yīng)體積的裂解液（加入終濃度為 1mM 的 PMSF，適當(dāng)濃度的蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑，以避免內(nèi)源性酶分解蛋白， 影響蛋白質(zhì)的抽提）進行勻漿。
蛋白質(zhì)的樣品制備是 western blotting 的第一步，也是關(guān)鍵步驟，要求可獲得所有蛋白 質(zhì)，應(yīng)注意以下問題：
（1） 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。
（2） 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價 二硫鍵，使其形成各自多肽的溶液。
（3） 盡量去除核酸，多糖，脂類等分子的干擾，在裂解完畢離心之后小心取中層澄 清溶液，注意不要吸到底層沉淀和上層脂類。
（4） 防止蛋白在處理過程中的人為修飾，制備過程必須在低溫下進行，以避免細(xì)胞 破碎釋放出各種酶類的修飾。（可以加入 PMSF 等酶抑制劑）
（5） 樣本制備完后分裝保存，但是注意不要反復(fù)凍融
二． 凝膠的制備
均一膠的制備，分子量較小的蛋白選用較大濃度的凝膠。
30%的 PAG 配置完后過濾于 4℃保存。10%SDS 室溫保存。AP 不穩(wěn)定，用時現(xiàn)配。
制膠關(guān)鍵是聚合時間，分離膠聚合控制在從加入 10%AP 和 TEMED 至開始凝膠,時間 為 10-20min（未完全凝聚）。濃縮膠最佳聚合時間為 8-10min。可通過控制 AP 和 TEMED 量來控制。AP，TEMED 的量過高，局部膠凝的太快，會使凝膠不均勻，電泳蛋白條帶會 彎曲。環(huán)境溫度較高時，應(yīng)減少 AP，TEMED 的量。 空氣中氧氣也會影響膠的聚合，所以 在分離膠上面應(yīng)加一層水或正丁醇以隔絕氧氣。
三． 電泳常見問題：
（1） 條帶出現(xiàn)“微笑”現(xiàn)象（中間凹兩邊翹起）：主要是凝膠中間部分凝固不均所致， 應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻。
（2） 條帶出現(xiàn)“皺眉”現(xiàn)象（中間鼓坡兩邊向下）：兩玻璃板之間底部氣泡所致，應(yīng) 排除底部氣泡。
（3） 帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象：主要是樣本溶解效果不佳；分離膠濃度過大，電泳緩沖液放置時間過長。建議：加樣前離心，選擇適當(dāng)?shù)臉颖揪彌_液，加適量的樣品促溶 劑；使用新配置的電泳緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠。
（4） 蛋白條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象：樣品不溶性顆粒引起的。建議：加樣前離心，加入適 量的促溶劑。
（5） 指示的溴酚藍已跑出底板，但蛋白質(zhì)未跑下來：與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 應(yīng)更換正確 PH 值的緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠
四． 轉(zhuǎn)印
濕式電轉(zhuǎn)印注意事項：
（1） 要使蛋白質(zhì)組分能有效的從凝膠轉(zhuǎn)移到固相紙膜上，緩沖液的 PH 值很重要。 有些分子量不是很大的蛋白質(zhì)區(qū)帶，即使延長電轉(zhuǎn)印時間也不能從凝膠轉(zhuǎn)移到 膜上。這是由于蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液中恰好處于等電點狀態(tài)造成的，因此應(yīng)適 當(dāng)改變轉(zhuǎn)移緩沖液的 PH，以利于轉(zhuǎn)膜。另外，對于分子量較小的蛋白質(zhì)，可 在緩沖液中加入適量甲醇，因為甲醇能促進它們固定在固相膜上。但是對于大 分子量的蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)，緩沖液中是不宜加入甲醇的，因為甲醇 使凝膠孔徑變小，不利于分子量較大的蛋白的轉(zhuǎn)移，甲醇能將結(jié)合在堿性蛋白 質(zhì)上的 SDS 解離出來而使其帶正電或呈電中性，蛋白質(zhì)就更難從凝膠中轉(zhuǎn)移出 來。
（2） 電轉(zhuǎn)印膜的選擇：有 NC 膜，重氮化膜和陽離子尼龍膜，PVDF 膜。其中 NC 膜使用的最為普遍，它的蛋白質(zhì)容量大，可用各種染色方法進行檢測，但是它 與蛋白質(zhì)的結(jié)合是非共價性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔徑大小也是考慮的 重要因素，目的蛋白 30KD 以下用 0.22um 孔徑的 NC 膜，30KD 以上用 0.45um 孔徑的 NC 膜。
（3） 轉(zhuǎn)印選擇恒流，每個轉(zhuǎn)印槽 150mA,10KD 以下轉(zhuǎn)印 40min，10-30kd 轉(zhuǎn)印 50min， 30-100KD 轉(zhuǎn)印 70min，100kd 以上轉(zhuǎn)印 80min，轉(zhuǎn)印完畢可用麗春紅 S 染膜， 檢測轉(zhuǎn)印是否成功，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，去除 NC 膜置于麗春紅 S 溶液中，室溫 5-10min 即可看見紅色條帶，用 TBS 洗數(shù)次即可洗掉紅色條帶進行后續(xù)實驗。
五． 封閉
（1） 電泳轉(zhuǎn)膜過后，膜上其他沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的空白位置需要用封閉液加以封閉， 以避免一抗或二抗非特異性結(jié)合。這是由于 WB 的靈敏度很大程度上取決于封閉的好壞，封閉時間過長（過度封閉）導(dǎo)致抗原表位的遮蔽，從而降低檢測靈 敏度；封閉時間過短（不完全封閉）又會導(dǎo)致最終背景增高或信噪比太低，因 此封閉液的選擇和條件的優(yōu)化很重要。
（2） 封閉液中應(yīng)加入適量的防腐劑，避免封閉蛋白變性影響封閉效果。
六． 抗體的雜交
（1） 若非特異性條帶過多，可適當(dāng)降低抗體的濃度，增加洗膜次數(shù)，蛋白電泳前延 長變性時間，減少上樣蛋白量，延長封閉時間。
（2） 若信號弱，可能轉(zhuǎn)膜不完全，可優(yōu)化轉(zhuǎn)移時間和電流，增加抗體的濃度，適當(dāng) 延長曝光時間。
（3） 若背景較高，可適當(dāng)降低抗體的濃度，過濾二抗，延長封閉時間，增加漂洗時 間，減少曝光時間。
七． 檢測
（1） 膠片曝光幾秒到數(shù)分鐘，具體情況要看膜上化學(xué)發(fā)光條帶明暗強度而定。膠片 曝光時間不宜過長，時間過長會照成膠片背景變深。沖洗膠片以確定所測抗原 的正確曝光時間。
（2） 沖洗膠片的步驟：曝光完的膠片先在顯影液中沖洗至出現(xiàn)條帶為止，一般在 1min 以內(nèi)，時間過長也會照成膠片背景變深。再放入定影液中漂洗，十秒即可。 顯影液漂洗完后，要多用清水沖洗，以免定影液中成分殘留在膠片上。
